Por Michael D. Graham

(Este artículo fue publicado originalmente en la desaparecida revista Brewing Techniques en el número de marzo/abril de 1977)

La compañía de Biotecnología para la cual trabajo posee una de las colecciones de microorganismos más grande del mundo.

Dado este ambiente, era natural que yo comenzara a coleccionar levaduras luego de comenzar con mi hobby de hacer cerveza casera cuatro años atrás.

Al pasar el tiempo, me di cuenta que necesitaba un método práctico, seguro y conveniente para almacenar las levaduras que coleccionaba.

Lo que he aprendido a través de cuidadosos experimentos le puede ser útil a otros “Homebrewers” y a Pub’s y Microcervecerías que estén familiarizadas con técnicas de cultivo de levaduras pero limitados por recursos de laboratorio.

Al principio, yo almacenaba mis cultivos en “picos de flauta” (tubos con planos inclinados de Agar Agar). Cada par de meses yo los transfería a Agar fresco, pero la tarea se hizo cada vez más ardua a medida que su número creció.

Cuando mi colección eventualmente superó las 50 cepas. Comencé a explorar diferentes métodos de almacenar mis cultivos.

Primero tomé muestras de cada cultivo para trabajar y la almacené en Nitrógeno líquido de forma de tener un juego original de muestras contra las cuales poder comparar los resultados de experimentos subsecuentes.

El nitrógeno líquido almacena cultivos a – 196 ºC, esencialmente detiene toda actividad metabólica. A esta temperatura se pueden mantener organismos en forma indefinida.

Una vez que mi muestra control fue almacenada en forma segura, me dediqué a explorar y evaluar alternativas de almacenamiento promisorias.

Encontré cuatro métodos que pueden ser realizados en forma hogareña (1) y he ensayado cada uno con varios cultivos hasta que descubrí el que dio mejores resultados.

Este artículo, presenta mis hallazgos.

Las cuatro técnicas básicas

Picos de Flauta (Planos inclinados): El primer método consiste simplemente en mantener los cultivos en planos inclinados con Agar Agar y nutrientes como he hecho desde el principio.

No creo que este método sea práctico para mantener cultivos para más de algunos, debido a que la levadura debe ser mantenida refrigerada y diligentemente transferida cada par de meses o ellas morirán.

Aceite mineral: Para el segundo método, he cubierto mis planos inclinados con aceite mineral estéril. Esta cobertura de aceite previene a la muestra de secarse y sirve como una barrera de oxígeno. Las levaduras pueden vivir sin oxígeno, pero el aceite enlentece la división celular, aumentando la longevidad de la célula. Este método aumentará el máximo tiempo entre transferencias a cerca de 6 meses, de cualquier forma los cultivos deben ser mantenidos refrigerados, y el aceite es molesto.

Silica Gel: Mi tercer técnica de preservación es la disecado con silica gel. Silica Gel es una sustancia extremamente higroscópica (absorbente de humedad) usada para secar y como agente dehumidificante.

Los tubos de Silica Gel se esterilizan y secan calentándolos cerca de 177ºC durante 90 minutos, luego enfriados. Una centrífuga se usa para suspender levaduras en una mezcla de leche / agua destilada, la cual es luego introducida en los tubos enfriados de Silica Gel y se almacenan luego en un freezer “Non Frost” ( el proceso de ciclado térmico de la heladera mataría a las levaduras).

Un simple cristal de gel congelado puede ser perforado para inocular un cultivo de 3 – 5 ml.
Las levaduras almacenadas de esta forma pueden sobrevivir un año o más.
La ventaja de este método sobre otros es que puede servir también para almacenar bacterias de uso en cervecería (Pediococcus para producciones lámbicas) por largos períodos de tiempo.

El agua estéril es muy tóxica para la mayoría de las bacterias y el Lactobaccillus usualmente muere en aproximadamente una semana cuando se los deja en tubos. La desventaja es clara, este método puede ser un desafío para implementarlo.

Agua Destilada: La aproximación que encontré como la mejor para el laboratorio hogareño fue el método del agua destilada. Es eficiente desde el punto de vista del espacio, fácil de realizar, permite almacenar los cultivos a temperatura ambiente y mantiene su viabilidad por años.

El agua estéril fue usada por primera vez para preservar cultivos micológicos por Castellini en 1939 (3). Desde entonces, muchos científicos usaron este método; McGinnis et al. (4) y Odds (5) informaron de que ellos fueron capaces de mantener cultivos viables por mas de tres años.

El Método del agua destilada para preservación de levaduras.

La técnica para almacenar levaduras en agua destilada es muy simple. Será rapidísimo para cerveceros ya familiarizado con alguna técnica de cultivo de levaduras, sobre todo para aquellos detallistas que mantienen un ojo bien abierto a los contaminantes potenciales.

Los requerimientos de material son modestos (ver en apartado al final del artículo “Qué se necesita”) y los premios – especialmente si tiene la chance de conseguir una cepa excepcionalmente rara – pueden ser inmensamente satisfactorios.

Técnica Estéril: Es absolutamente necesario que al intentar cultivar levaduras Ud. siga técnicas estériles. Lave sus manos, limpie y desinfecte la superficie de toda el área de trabajo, esterilice todo lo que entrará en contacto con sus cultivos, pase por la llama el labio de todos sus recipientes y minimice al máximo el polvo y corrientes de aire.

Procedimientos para el almacenamiento de levaduras en agua destilada: Primero, Ud. necesitará un tubo con Agar en plano inclinado o pico de flauta o una placa de Petri con la levadura que Ud. desea preservar.

Este cultivo debe ser FRESCO y LIBRE de CONTAMINANTES. Si el cultivo tiene mas de un mes, es una buena idea inocular otro tubo para ver su viabilidad. Un cultivo a 30 ºC crecerá lo suficiente para producir colonias visibles en uno o dos días cuando se los mantiene sobre placas de Petri.

Criar cultivos a temperatura ambiente puede extender el período de 2 a 4 días.

Trabajar con cultivos frescos es importantes porque estos demostrarán una mayor longevidad cuando se los preserva que aquellos cultivos viejos y cansados.

Con levaduras fuertes y vigorosas a mano, es tiempo de preparar los tubos.

Llene los tubos a un tercio (cerca de 2 mL) con agua destilada y coloque la tapa enroscándola algo floja de forma que el vapor pueda entrar y salir libremente del tubo. Coloque los tubos parados en un porta tubos y esterilícelos en una olla a presión a 15 psi (1,055 Kg/cm2) por 20 minutos.

Una vez que ha preparado sus tubos estériles y un área de trabajo estéril, utilice su lazo de inoculación estéril para recoger un lazo lleno de levaduras y transferirlo al tubo de agua destilada estéril. Cierre la tapa firmemente y séllela con cinta de aislar eléctrica, de forma de asegurar que está sellada respecto del medio ambiente, y sacuda el tubo firmemente de forma de diluir los terrones de levadura. La levadura formará un sedimento blanquecino en el fondo del tubo si se la deja quieta una o dos horas.

Guarde los tubos conteniendo el cultivo preservado lejos de la luz diurna y en un área alejada de las fluctuaciones térmicas. Yo guardo las mías en una biblioteca. Ud. puede refrigerarlas, pero no es necesario. Tenga en cuenta que la mayoría de las heladeras están repletas de organismos contaminantes.

Reanimando las levaduras para producir cerveza: Inicie el proceso de cultivo una semana antes de que Ud. planea cocinar su cerveza. La levadura que Ud. ha guardado está en un estado durmiente, y los tubos poseen demasiado pocas levaduras para fermentar en forma efectiva su cerveza.

El primer paso es entonces reanimar las levaduras y de allí comenzar una escalada de inyección creciente. El mejor método de hacer esto es sacudir el tubo para poner en suspensión a las levaduras e insertar el lazo estéril para capturar levaduras y luego sembrarlas en un Tubo con plano inclinado o placa de Petri con Agar Agar.

Una vez que las colonias han crecido (un par de días después) Ud. puede inocular con ellas 5 mL de mosto estéril u otro medio líquido rico usando el lazo estéril.

Recomenzando el proceso de cultivo en tubo con planos inclinados de Agar Agar tiene sus ventajas.

1) Le permite visualizar el crecimiento de las colonias para inspeccionar por cierto tipo de contaminantes. El moho será visible (negro + erizado = MALO), pero tenga en cuenta que muchos contaminantes pueden no ser detectados visualmente.

2) El cultivo de levaduras acorta el tiempo de retrazo, levaduras que están creciendo activamente en Agar Agar no perderán tiempo una vez que estén en contacto con el mosto

3) Si Ud. cierra el plano inclinado firmemente y lo mantiene a 4ºC la levadura permanecerá viable por varios meses (al menos 2 meses) permitiéndole usarlo de nuevo en subsequentes sesiones de cocción de su cerveza o para dárselo a un amigo. Si Ud. necesita guardar sus tubos en su heladera, previamente colóquelos tubos en una bolsa tipo Zip-Lock (con cierre) de plástico y desinfecte la parte externa de la bolsa cuando la retire de la heladera y previo a extraer los tubos de la bolsa.

Aireación es muy importante para los cultivos de levadura en reproducción, es por ello que recomiendo agitar los tubos con levaduras en crecimiento cada par de horas. Una vez que el tubo de 5 mL ha alcanzado el “high krauzen” (espuma marrón) (a las 24 horas), utilícelas para inocular un mosto de 50 mL. Después de 24 horas estará nuevamente en “high krausen” y listo para inocular un mosto de 500 mL.

Estará listo para inocular una cocción de hasta 20/30 litros y deberá hacer un paso más si necesita inocular 50 litros de cerveza verde.

El mejor momento para inocular el cultivo en el mosto es inmediatamente cuando se ha calmado el “high krausen”.

Si su cocción no está lista cuando ya está listo su cultivo para inocular, este cultivo permanecerá totalmente usable por uno o dos días más hasta que el “high krausen” haya finalizado y puede mantener en la heladera este volumen de inoculación durante una semana (desinfecte el exterior antes de reusarlo), pero aumentará el tiempo de arranque, el cual puede incidir adversamente afectando su cerveza.

Pudiera parecer intuitivamente plausible que pueda disminuir su esfuerzo inoculando 1 litro de mosto desde su stock de agua destilada. Aunque intuitivo esto no funcionará. A pesar de sus mejores esfuerzos para mantener condiciones estériles, siempre habrá organismos contaminantes penetrando en sus cultivos. A pesar de que el uso de mostos lupulizados disminuirá contaminaciones bacterianas, no hará nada para proteger contra hongos o levaduras salvajes. Su mejor defensa contra los contaminantes es contrarrestarlos con un gran número de su excelente levadura. Para hacer esto, aumente el volumen en pasos de no mas de 10 hasta que alcanzó el volumen requerido de inoculación.

Control de contaminación: Abriendo en forma repetida año tras año llevará eventualmente a la contaminación.

El impacto de un cultivo contaminado en su colección de levaduras puede ser minimizado. Para reducir la probabilidad de que pierda un cultivo, hago tres tubos de cada cultivo y lo uso exclusivamente hasta que el mismo se contamina. Descarto el primer tubo y verifico el segundo para ver si está contaminado, si el segundo se ve bien, lo uso para hacer un cuarto tubo. Cuando el segundo está contaminado uso el tercero para hacer un quinto tubo y así sucesivamente checkeando cada vez por si hay contaminación.

Seguridad, posibilidad, conveniencia y facilidad

Armado con una firme técnica estéril y un poco de práctica, Ud. puede mantener en forma segura muchos cultivos usando una variedad de métodos. De las cuatro muestras que comencé hace un año, la de los dos primeros métodos ya están muertos, mientras que el de silica gel y el de agua destilada son aún viables. De estos dos, el de agua destilada parece ser el más práctico, la técnica más preservativa para ser usada por cualquier HomeBrewer.

Ningún otro método le permite almacenar cultivos en forma estable por períodos de tiempo tan largo. En mi experiencia, no ha causado pérdidas de viabilidad, es barato, no tiene mayor dificultad que cualquier otro método de almacenamiento. Los cultivos pueden ser mantenidos a temperatura ambiente y ocupan muy poco espacio. Más importante aún, las cervezas fermentadas con estos cultivos no pueden ser distinguidas en modo alguno de aquellas primeras cepas que he guardado en nitrógeno líquido.

El cultivo de levaduras no es para cada uno, pero la satisfacción que trae verse envuelto a este nivel de la producción de su cerveza vale el tiempo extra y el esfuerzo.

Michael Graham es un microbiólogo que trabaja en ATCC ( American Type Culture Collection) en Rockville, Mariland USA. Ha invesigado ADN humano en ATCC desde 1991, es Homebrewer desde 1992 y se dedica exclusivamente a cocción de Todo-Grano desde 1994. En 1995 se construyó su propio RIMS. Es juez de eventos certificado, pero no se dedica solo a la cerveza es también miembro de la Sociedad de Whiskey de sólo Malta.

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