Levadura

La levadura es para la cerveza lo que el oxigeno para la vida del hombre, de su vitalidad depende la conversión de los azucares solubles fermentables en alcohol. La levadura de cerveza contiene 17 vitaminas, todas las del grupo b, 14 minerales y 46% de proteínas.

Clasificación de las levaduras

Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen pe gemación. No encajan perfectamente en ningún grupo de hongo por lo que parece apropiado revisar, siquiera sea someramente, clasificación de los hongos en general.

Ficomicetos

Los ficomicetos desarrollan normalmente micelios, tubos ramificados, protegidos por una pared, de diámetro bastante uniforme, que contienen citoplasma y numerosos núcleos. Los micelios de los ficomicetos no tienen septos transversos. Algunos (como los mohos del pan, Mucor y Rhizopus) tienen células sexuales masculinas y femeninas de igual tamaño y forma. Otros tienen células sexuales femeninas de mayor tamaño, por ejemplo Pseudoperonopora, el responsable de la peronóspora del lúpulo.

Ascomicetos

Los ascomicetos tienen micelios divididos por septos trasversos poseen esporas características (ascosporas), producidas en sacos, nominados aseas, una vez que se ha producido la fusión sexual. Otras esporas, llamadas conidios, no proceden de la unión sexual. Cnstituye el grupo más numeroso de los hongos y en el se incluyen muchas levaduras, como los Saccharomyces, y hongos, como los pergillus y Penicillium, muy usados en las industrias microbiológicas.

Basidiomicetos

Los basidiomicetos también poseen micelios divididos por redes transversas, pero sus basidiosporas se forman en cuatro ecrescencías de una célula característica, denominada basidio. La roya y el carbón de la cebada constituyen ejemplos de basidiomicetos, pero más familiares resultan los champiñones o los níscalos o rovellones. A este grupo pertenecen las levaduras del género -Sporobo-lomyces que posee esporas externas, poco corrientes denominadas balistosporas.

Fig. 7.1 1. Esquemas de (a) Saccharomyces cerevisiae (gemación multilateral), (b) Schiwsaccharomyces pombe (fusión binaria), (c) Nadsonia sp (gemación bipolar), (d) pseudomicelio de Pie/lia membranaefaciens. 2. Aseas y ascosporos de (a) Saccharomyces sp, (b) Pichia sp y (c) Hansenula saturnus. Ampliaciones: las células maduras de (a) tienen 8-10 ^m de diámetro; las de \(b) y (c) son de tamaño similar; y (a), (b) y (c) están representadas con ampliaciones 2 veces superiores a los de l(a). (b) y (c); \(d) lo está a 1/2 de las de \(a), (b) y (c)

Hongos imperfectos

Este grupo representa un cajón de satare, al que pertenecen especies cuyos procesos reproductivos se desconocen y en los que se encuentran, por tanto, esporas características. Ocasionalmente se descubre, en algunas de ellas, la presencia, por ejemplo, de ascosporas y automáticamente se retira la especie en cuestión de este grupo y se la clasifica como Ascomiceto. Ejemplos de estos hongos son el Verticillum del lúpulo y el Fusarium, que infecta la cebada. Muchas levaduras se encuentran también incluidas en este grupo (por ejemplo especies de Candida).

Las levaduras comprenden 39 géneros y 350 especies. Se identifican y clasifican, basándose en características morfológicas y fisiológicas. Entre los aspectos morfológicos considerados, se encuentran el tamaño y la forma de las células, en medio sólidos y líquidos especificados, el modo de reproducción y si forma velo en la superficie o sedimenta en un medio líquido. Entre las características fisiológicas consideradas, se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de nitrógeno, como los nitratos.

Las células de las levaduras pueden ser ovales, esféricas, tener forma de limón o de cigarro puro. Pueden dividirse mediante gemación, acaecida en cualquier lugar de la superficie, o sólo en los extremos, o polos. Algunas no forman gemas, pero exhiben todas las demás características del grupo; forman simplemente un tabique en el interior de la célula, tras elongarse. Hay levaduras que forman, especialmente en medio sólido, filamentos, ramificados o no, denominados pseudomicelio; otras ofrecen micelos muy similares a los de los mohos.

Una de las características fisiológicas de los Saccharomyces que ayuda a su identificación es la de que no utilizan el nitrato como fuente de nitrógeno, frente a lo que hacen algunos otros géneros, como Hansenula. Saccharomyces cerevisiae, se distingue de Saccharomyces carisbergensis, la otra levadura de la cerveza, en que la primera no fermenta el azúcar melibiosa y la segunda sí. Ambas utilizan la galactosa, en tanto que las levaduras que participan en el envejecimiento del jerez, S. bayanus, no la fermenta. Todas las especies de Saccharomyces mencionadas fermentan la maltosa, que no es en cambio utilizada por S. capensis.

Diferenciación serológica

Las técnicas serológicas constituyen un método rápido para lia identificación de cepas.

En unos casos son extremadamente valiosas, aunque en otro resultan de difícil aplicación. Las pruebas serológicas dependen d una reacción muy especifica entre anticuerpos obtenidos de sangre de mamíferos y antígenos (o sustancias orgánicas extrañas introducidas en su sangre). Constituye uno de los mecanismos clave de 1a defensa de nuestro propio organismo; le permite luchar con éxito contra las infecciones bacterianas y contra las células extrañas, al igual que contra rnmacromoléculas orgánicas.

Se inyectan a un conejo, por ejemplo, células cuteras, desvitalizadas, de una cepa (A). El animal inyectado produce anticuerpos, con grupos químicos específicos que complementan los de la superficie de la célula, que actúan como amigónos. Al cabo de una serie de inyecciones, se retira un cierto volumen de sangre, que se libera de glóbulos rojos para obtener el suero, que se puede conservar durante largos periodos de tiempo, si se almacena a refrigeración en presencia de algún conservador. Cuando se mezcla con una suspensión de la levadura de la capa A, el suero aglutina las células; de hecho, aglutina a todas las cepas que exhiban, en su superficie, alguno o algunos de los grupos que actúan como antígenos.

Supongamos que el suero (al que se denomina antisuero de la capa A) se mezcla con células de una cepa emparentada, B. La cepa B será aglutinada y gastará los anticuerpos que reaccionan con ambas.

El antisuero absorbido no tendrá ya anticuerpos capaces de reaccionar con células de la cepa B, pero es posible que pueda aglutinar a las células de la cepa A, porque ésta probablemente tenga grupos, o antígenos, no compartidos con la cepa B. Se puede hacer uso de este principio del modo que se indica en la Tabla 7.1, para establecer las relaciones existentes entre cepas, especies o géneros; pero también se puede usar para identificar cepas desconocidas.

Resulta útil la posibilidad de acoplar los anticuerpos a colorantes fluorescentes, dado que así los anticuerpos que reaccionan con una determinada cepa de levadura fluorescen en su superficie, con lo que basta con cantidades de anticuerpos mucho más reducidas que las que se necesitan para las pruebas de aglutinación. Con un microscopio adecuado e iluminación de cuarzo-iodo, es posible identificar células Fluorescentes individualizadas entre miles de no fluorescentes, lo que hace posible detectar la presencia de levaduras no deseadas (las llamadas levaduras salvajes), a bajas concentraciones, en medio de un cultivo de lavadura, siempre que sea posible preparar un antisuero que reaccione con las levaduras salvajes y no con las del cultivo. Se puede potenciar el grado de fluorescencia de una célula mediante una modificación de la técnica, en lugar de acoplarlo a un colorante, se inyecta a una cabra el antisuero absorvido, a partir de la sangre de esta se obtiene un antisuero contra el antisuero del conejo, que es el que se acopla al colorante. Para detectar las células salvajes, se añade primero a la suspensión de levaduras el antisuero absorbido y luego el antisuero de cabra fluorescente. Las levaduras salvajes se recubren de una primera capa de anti-suero de conejo y una segunda de antisuero de cabra (anti-conejo). De este modo la levadura se puede recubrir con más moléculas de colorante que si se usara la técnica de una sola capa.

Estructura de la célula de levadura

Una célula de una levadura de cereza típica tiene, cuando se halla plenamente desarrollada, entre 8 y 14 nm de diámetro y una masa de materia seca de 40 pg. Por tanto 10¹² células desecadas pesan unos 40 g. En vivo, prensadas, ese mismo número de células pesan unos 200 g. El examen al microscopio ordinario revela que cada célula está rodeada por una pared y que en el interior de la misma se pueden distinguir pocas estructuras, salvo una o más vacuolas. Para observar el núcleo y varios otros orgánulos se necesita recurrir a preparaciones teñidas, o a la microscopía de contraste de fases. La superficie de las levaduras se puede estudiar mediante microscopía electrónica de barrido y las estructuras internas mediante microscopía electrónica de transmisión, sobre preparaciones fracturadas por congelación, frescas, no fijadas. En la Figura 7-23, se muestra un diagrama de la sección de una levadura de cerveza típica. Una información más detallada de las partes de la célula exige la identificación bioquímica de sus componentes.

La pared celular representa el 30 % del peso seco total y tiene un grosor de 100-200 nm. Está constituida por aproximadamente un 40 % de (3 glucanos, otro 40 % de a mananos, 8 % de proteína, 7 % de lípidos, 3 % de sustancias inorgánicas y 2 % de hexosamina y quitina. El glucano está unido a la proteína y representa el componente estructural más abundante; se halla fundamentalmente en la cara interna de la pared. El tamaño se encuentra también ligado a la proteína, a veces a través de hexosamina, y tiende a localizarse en la cara externa de la pared. La superficie de la célula se encuentra cargada, debido a la presencia de grupos carbóxilo y fosfato que, al pH de la cerveza, la confieren una fuerte carga neta negativa. También se encuentran grupos amino, pero sólo le confieren regiones locales de carga positiva. Las paredes celulares se pueden disolver mediante el uso de una preparación enzimática mixta, procedente de un actinomiceto denominado Arthrobader luteus, o de la glándula digestiva de un caracol comestible, Helix pomada. Generalmente, se requiere un agente reductor, como el mercaptoetanol. Si se mantienen en un estabilizador osmótico, como una disolución acuosa de manitol al 20 %, las células de levadura permanecen intactas, pero esféricas, al haber perdido su pared; se les denomina esferoblastos y, si las condiciones culturales son las adecuadas, resintetizan sus paredes. Algunas técnicas de manipulación genética explotan estos hechos.

Fig. 7.23  Diagrama de una electronografía de la sección transversal de una célula en reposo de levadura de panaderos (Saccharomyces cerevisiae). ER, retículo endoplásmico; M, mitocondrias; N, núcleo; Nm, membrana nuclear; Nn, nucléolo; Pi, invaginación; Pl, plasmalerna; V, vacuola; Vp, granulo de polimetafosiato; W, pared celular; Ws, cicatriz de gemación; L granulo lipídico.

Las levaduras se multiplican por gemación. Una zona debilitada de la pared permite que se forme una prolusión del citoplasma, a la que, de inmediato, se provee de pared. A medida que crece, van emigrando a la gema los orgánulos de la célula madre, incluido un núcleo (tras su división). Finalmente, la gema alcanza su tamaño definitivo, lo que no implica necesariamente su separación de la célula madre. Es bastante frecuente encontrar largas cadenas de levaduras, debido a la no disyunción de las distintas células formadas. Si las células madre e hija se separan, en la primera queda un anillo denominado cicatriz de gemación, fácilmente distinguible; el de la célula hija es más difícil de distinguir. Una sola célula puede dar lugar a más de 30 gemas a lo largo de su vida, pero es raro que en ningún momento se encuentren juntas más dé dos o tres.

La pared celular es permeada por algunos de los enzimas segregados por la levadura; el más importante es la invertasa, que hidroliza la sacarosa antes de que penetre en la célula; entre ellos se encuentra también la fosfatasa. Saccharomyces carisbergensis segrega melibiasa, pero Saccharomyces cerevisiae no. Algunas levaduras segregan cantidades apreciables de proteasas, pero las del género Saccharomyces sólo tienen una actividad de este tipo limitada.

El citoplasma se halla envuelto por una membrana viva, el plasmalerna, que no sólo recubre al citoplasma, sino que se ramifica, uniéndose con la red membranosa interna. Estas estructuras están constituidas por lípidos, entre ellos fosfolípidos y esteróles, y proteínas. El plasmalena juega un papel importante en la regulación del flujo de todos los materiales tanto hacia el interior como hacia el exterior de la célula. Las demás membranas probablemente compartimentalizan la célula y le proporcionan una superficie en laque operan determinados enzimas.

El núcleo de las levaduras ofrece un diámetro de 1,5 ^m y está rodeado por una doble membrana. En su interior se alberga un área densa, en forma de media luna, a la que se denomina nucléolo. Los cromosomas no son distinguibles, pero hay pruebas genéticas que indican la existencia de al menos 17 pares y varios fragmentos en las células diploides (véase pág. 117).

Las células de levaduras en crecimiento rápido ofrecen varias vacuolas, pero las maduras, normalmente, sólo muestran una. Dentro de su membrana única, se encuentran partículas densas, de polifosfato, a las que tradicionalmente se denomina granulos de velutina. Cuando crecen en condiciones aeróbicas, y en especial si la concentración de glucosa es escasa se observan varias mitocondrias en el interior de cada célula. Cada mitocondria está rodeada por una doble membrana. Las mitocondrias albergan a los citocromos a los enzimas respiratorios y al sistema responsable de la biosíntesis de adenosin trifosfato (ATP). Son, por tanto, las responsables del metabolismo oxidativo de los azúcares, que se degradan a dióxido de carbono y agua; el ATP que sintetizan almacena la energía química derivada de estas reacciones. En condiciones anaeróbicas, o cuando las concentraciones de glucosa son altas, las mitocondrias parecen atrofiarse y perder, al menos temporalmente, su actividad bioquímica. Estos cambios pueden apreciarse fácilmente, observando el espectro de los citocromos de la levadura. Un una levadura en aerobiosis, el espectro tiene cuatro bandas., en lanío que en anacrobiosis sólo muestra dos.

Las flores de la planta del lúpulo (también llamadas conos o piñas) contienen en su interior unas glándulas de color amarillo. Estas glándulas están llenas de una resina llamada lupulina, que es el principio activo que los cerveceros buscan en el lúpulo. La lupulina aporta:

a. Componentes amargos. Son aportados principalmente por los llamados ácidos alfa. Dotan a la cerveza de su característico amargor, contribuyen a la formación de espuma y ayudan a la conservación de la cerveza.

b. Componentes aromáticos. Son los llamados aceites esenciales. Incorporan aroma y sabor a la cerveza.

c. Taninos. Contribuyen a la conservación.

De estos tres componentes los más relevantes son los dos primeros y por eso aprenderemos un poco más sobre ellos.

- Componentes amargos

El amargor del lúpulo proporciona el contrapunto adecuado al dulzor de la malta. Este sabor amargo es extraido del lúpulo durante la cocción. Mediante ella, los ácidos alfa insolubles se isomerizan en ácidos iso-alfa más solubles.

Se han conseguido aislar en el laboratorio cinco ácidos alfa que están presentes en el lúpulo de forma natural; en proporciones que varían según la variedad:

humulone

cohumulone

adhumulone

prehumulone

posthumulone

Además de ácidos, el lúpulo también contiene ácidos beta, los cuales también añaden amargor a la cerveza cuando se oxidan. Sin embargo, los ácidos beta oxidados no son tan amargos como los ácidos alfa isomerizados y contribuyen mucho menos al amargor final de la cerveza.

Los ácidos alfa son muy susceptibles a la oxidación (sobre todo a temperaturas elevadas) y cuando esto ocurre ya no pueden ser isomerizados en ácidos iso-alfa, lo cual merma significativamente su capacidad de amargor. Esta es una característica que hace que su almacenamiento y conservación sean muy delicados. Los cerveceros deben tener ésto muy en cuenta y, por ello, tratan de conseguir lúpulos lo más frescos posibles y de guardarlos en frío (cámaras frigoríficas) y en condiciones anaeróbicas (libres de oxígeno).

- Componentes aromáticos

Los investigadores no han sido capaces, hasta ahora, de reproducir la complejidad de aromas del lúpulo añadiendo componentes químicos sintéticos. También añaden amargor a la cerveza cuando se oxidan. Sin embargo, los ácidos beta oxidados no son tan amargos como los ácidos alfa isomerizados y contribuyen mucho menos al amargor final de la cerveza.Ni tampoco utilizando otro tipo de plantas o especias.

Existe un consenso generalizado sobre que son las sinergias que se producen entre los distintos componentes del lúpulo las que le confieren su inimitable capacidad aromatizante. Mediante técnicas cromatográficas se han conseguido identificar más de 250 aceites esenciales y todavía existen otros muchos aún desconocidos.