Cultivo de Levadura

Elementos

- Medio sólido de Cultivo: Puede ser usado para este fin “Agar Glucosado”, o un  preparado de “gelatina – mosto estéril”
- Medio líquido para inocular: Mosto estéril de una partida anterior, Preparado de malta líquida diluida a una densidad determinada.
- Glicerina.
- Anza o laso
- Placa de petri
- Tubos de ensayo con tapón
- Erlenmeyer o frasco de vidrio con tapa 500ml., que soporte alta temperatura.

Proceso

Para realizar un cultivo de levadura, debemos partir de una Cepa de Levadura Confiable que puede ser:

1 – Cultivo puro: Es un cultivo como el que vamos a describir, que nos hayan cedido, sabiendo que se han llevado a cabo todas las precauciones necesarias para este fin.

2 – Levadura re-hidratada: Se abre un sobre de levadura deshidratada, se re-hidrata para ser utilizada en nuestra cocción, separamo una muestra de 5ml. en un tubo de ensayo con tapón, o pequeño envase con tapa que pueda ser esterilizado  previamente.

3 – Levadura líquida : Se activa la levadura según indicaciones del fabricante, al momento de ser utilizada en nuestra cocción, separamos una  muestra de 5ml. en un tubo de ensayo con tapón, o pequeño envase con tapa que pueda ser esterilizado previamente.

Recomendaciones

Es muy  importante trabajar en un ambiente limpio y libre de corrientes de aire.
Rociar previamente la mesa de trabajo con alcohol al 70%.
Que todos los elementos a utilizar sean esterilizados.
En lo posible trabajar al lado de un mechero bunsen u hornalla encendida.
Antes de comenzar, rociarse las manos con alcohol.

El primer paso es preparar el medio sólido de cultivos. Para esto debemos preparar el “Agar glucosado”, o la “gelatina con mosto”. Una vez que hicimos este paso, sin esperar que se solidifique, lo separamos en tubos de ensayo de a 10 / 15ml. aprox., y los esterilizamos en una olla a presión durante 15 minutos.

Esperamos que se entibien, y vertimos el contenido de un tubo sobre una placa de Petri. Tapamos la placa, dejamos enfriar, y con esto ya tenemos el medio listo para iniciar nuestros cultivos.

Partiendo de la “opción uno”, debemos seguir los pasos 1 y 2 indicados en el apunte Como preparar un Starter partiendo de una colonia de Levadura, hasta obtener lo ilustrado en la figura 3 del mismo artículo, y luego agitamos el tubo hasta ver que la levadura queda disuelta en el mosto (de ahora en mas el proceso es igual para las tres opciones)

Destapamos el tubo que contiene la muestra, sumergimos el anza en esta, cerramos el tubo, y desplazamos el anza sobre el medio sólido de cultivo como vemos en la figura-a

figura –a

¿porque cuando pasas a la placa de petri solo haces una cruz y no un reaislamiento? Ya que después de este se podría tomar una única colonia y partir de un cultivo puro.

Me fue explicado de esta forma, hacer una cruz "sigsagueando" al trasar. Ahora, un reaislamiento ¿te referís a depositar muestras aisladas en la placa?. Si es así, ¿se debe a evitar mutaciones por estar encimadas?

Sobre el reaislamiento, en él grafico se ve la forma de hacer los trazos con el anza, entre trazo y trazo hay que incinerar el anza y enfriarla bien, en el medio de cultivo o en alguna gota de condensación en la tapa de la placa. El problema de las mutaciones va más allá que solamente el amontonamiento de las colonias, tiene que ver con las condiciones de cultivo, las temperaturas de crecimiento, las fases de la luna y un muy largo etc.. Yo me refería a partir de una única colonia para asegurar la calidad del cultivo y poder visualizar bien la presencia de colonias de bacteria o mohos y no pasarlos al resto del proceso.

Una vez terminado este proceso, tapamos la placa de Petri, la envolvemos en un papel Aluminio previamente rociado con un poco de alcohol, y la dejamos con la tapa hacia abajo hasta lograr una cantidad de colonias suficiente (una semana aproximadamente).

Después de 2 días aproximadamente, veremos que empiezan a formarse pequeños puntos blancos en sectores aislados, que son las colonias de levadura que podemos ir tomando para seguir los pasos del apunte “Como preparar un Starter partiendo de una colonia de Levadura”.

Freezado de una muestra de levadura

Las placas de petri inoculadas, deben conservarse en frío dentro de un envase hermético mientras no sean utilizadas.

Estas placas conviene renovarlas cada 3 o 4 meses. Para este fin, podemos guardar los 5ml. de muestra dentro del freezer, y conservarlas durante un largo período. Y para esto, debemos mantener las células dentro de una solución que lubrique las paredes celulares para evitar su estallido.

Esta solución la preparamos diluyendo glicerina con agua en partes iguales, la esterilizamos, y una vez frío mezclamos los 5ml. de la muestra de levadura que tomamos para inocular las placas de petri con 5ml de esta solución. Cerramos el tubo, y lo guardamos en el freezer hasta su futura utilización.

Sobre el uso de glicerol, el glicerol no se congela con los cual quedan microgotas de glicerol en donde las levaduras quedan encerradas, como la temperatura es muy baja las levaduras no crecen, ni se mueren. Las técnicas de criopreservación sugieren que si uno va a congelar conviene ir bajando la temperatura de apoco, 12 hs a 4 ºC (heladera), 12 a –4ºC (congelador de la heladera) y después al freezer (-18 ºC). Si bien el freezer no es lo ideal anda muy bien.

Como preparar un Starter partiendo de una colonia de Levadura

Foto 1 

La foto1, muestra una placa de petri llena de pequeñas colonias de levaduras. Ahora vamos a ver paso a paso como tomando una de estas colonias, podemos llegar a tener la cantidad de levadura suficiente para nuestras cervezas.

Para poder empezar, debemos tener preparado

1 anza.
330ml. de mosto esteril,
1 falcon o tubo de ensayo con tapón
1 erlenmeyer.

1 – Un anza, es un alambre de con un pequeño rulito en la punta. Se vende en casas de productos para laboratorios. Los alambres de anzas que se venden son de platino o de Nicrom (no se si se escribe así) pero se bancan bien la incineración, los mangos de anzas no deben ser muy caros. Lo del alambre de Nicrom o platino, por experiencia puedo decir que cualquier otro material se carboniza muy rápido y pierden el temple y se ablandan como un chicle. Podemos hacerla nosotros mismos (en mi caso usé alambre de 0,5 mm, para poder usarla con un portaminas). El anza de rulo hay que esterilizarla antes de meterla en el facon.se puede hacer de dos formas, dependiendo de que material sea el mango, si es un mango de anza de los que se venden en las casas de materiales de laboratorios el anza se puede incinerar directamente a la llama, hasta que esté al rojo, y luego pasar el mango también por la llama, luego esperar unos segundos a que se enfrié cerca del mechero, nunca hay que soltarla y luego usarla. Si el mango es de plástico, se puede sumergir en alcohol y prender fuego, un par de veces, no es lo mismo que la incineración pero anda bien.

Tomamos  una colonia de nuestra placa de petri como muestra la fig. 1 y la pasamos dentro de un falcon con 5ml. de mosto esteril, moviendo el anza hasta ver que la colonia se desprende (fig 2). Tapamos el falcon, y agitamos un instante.

fig.1	fig. 2

2 - Al día siguiente (24hs. Aprox.) vamos a tener en el fondo del falcon, una cantidad de levadura como se ve en la fig. 3. Abrimos el falcon y agregamos mosto esteril hasta completar 35ml. como se ve en la (fig.4). Cerramos el falcon y agitamos nuevamente un instante.

- ¿se puede agitar el cultivo líquido, tanto en falcon como en erlenmeyer? A mi me parece que si agitas de vez en cuando mamtenes más aireado el cultivo con lo que vas a acelerar las cosas y obtener más biomasa, OJO no estoy diciendo agitar la cerveza, sino solo el cultivo.

Totalmente de acuerdo, ya que es lo que buscamos en la propagación. O sea, lo que se busca en la propagación, es mantener la fase aeróbica ¿es así?.

Sobre la fase aeróbica, a mi se me ocurre que vas a acortar más los tiempos y tener más biomasa, ya que cuando un cultivo esta en fase aeróbica se tiene una generación de levaduras cada 3 horas y en fase fermentativa solo vas a tener 3 o 4 generaciones en el tiempo que fermentas una cerveza. La única duda que me cabe es si con tanta fase aeróbica en algún momento no se perderían las características fermentativas de la cepa, ahora sí por selección de mutantes que crezcan más rapidos que las buenas fermentadoras, no lo se.

fig.3	fig.4

Nota: Luego de haber agregado mosto al falcon de la fig.4, podemos taparlo con la tapa del mismo, y destapar de vez en cuando, dando simplemente ¼ de vuelta para permitir la salida del Co2, o bien podemos poner un tapón con un Airlock como muestra la foto 2.

3 – Al día siguiente vamos a ver en el fondo del falcon una cantidad de levadura como se ve en la fig. 5. Movemos lentamente el falcon, de modo que se mezcle la levadura dentro del mosto, lo destapamos y lo pasamos a un erlenmeyer con mosto esteril como muestra la fig.6 (pero dejando muy poca cantidad dentro del falcon, 2ml. aprox*), tapamos el falcon y tapamos el erlenmeyer con un Airlock   

fig. 5	fig. 6

4 - En 24hs aprox. tendremos la suficiente cantidad de levadura para 30 ltrs. de mosto como muestra la fig. 7, movemos el erlenmeyer con el fin de mezclar la levadura con el mosto, lo destapamos, y lo pasamos al fermentador donde se encuentra el mosto verde, (dejando en el erlenmeyer muy poca cantidad del contenido, digamos que una pequeña película en el fondo de este). 

Luego de 24 hs. tendremos la cantidad de levadura suficiente para una partida de cerveza de 30 ltrs aproximadamente.

Talvez parezca un poco complicado, si esto habría que hacerlo en cada partida. Pero en el punto 3, entre paréntesis hablo de dejar “una pequeña cantidad de levadura”, ¿cuál es el motivo?, al pasar  del falcon al erlenmeyer, en esa pequeña cantidad nos queda la suficiente cantidad de levadura como para inocular 35ml. de mosto y en 24hs. tener la cantidad de levadura que se ve en la fig. 5. Este falcon lo podemos guardar en la heladera, y unos día antes de nuestra próxima partida, repetimos del punto 4 en adelante, ya que en el falcon tendremos una cantidad de levadura como la que se ve en la fig.5

¿Por qué dejamos una pequeña muestra en el erlenmeyer?. Ni bien echamos la levadura al fermentador, en esa “pequeña cantidad”, hay suficiente cantidad de levadura como para inocular unos 200 / 250ml. de mosto esteril, y tener levadura lista por si queremos hacer cerveza al día siguiente.

Si no hacemos cerveza al día siguiente, dejamos que las levaduras terminen su trabajo. Una vez que termina, movemos el erlenmeyer para mezclar la levadura depositada en el fondo, y la dividimos en tantos falcon como nos alcance poniendo 35ml. en cada uno, los tapamos y luego los guardamos en la heladera para futuras partidas, teniendo en cuenta que partiremos del punto 4.

Si queres dejas la espumita en el erlenmeyer, y así sucesivamente. ¿Cuántas veces? no lo se, cada vez me voy estirando un poquito mas. Sí creo que este método es mas confiable que la reutilización del “Barrito” (resto de una fermentación anterior), y con una menor degradación de la levadura.

NOTA: La temperatura ideal de propagación es de 30°c

TODO ESTO DEBE HACERCE TOMANDO TODAS LAS MEDIDAS DE ACEPCIA POSIBLES “LIMPIAR LA MESA CON LAVANDINA, LAS MANOS CON ALCOHOL, TRABAJAR AL LADO DE UN MECHERO DE BUNSEN ..........etc. etc.”

Lionel Vogrig - Diego Perrota

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